公卫执业医师考点:多肽链的分离
细胞核中DNA的某一区段转录出来的mRNA从核孔穿出来进入细胞质中,与核糖体结合起来。蛋白质合成就在核糖体进行。蛋白质开始合成时,首先核糖体与mRNA结合在一起,核糖体附着在mRNA的一端(起动部位),然后沿着mRNA从5′3′方向移动(当核糖体向前移动不久,另一个核糖体又结合上去,所以一个mRNA可以有多个核糖体连续上去)。
在测定一个蛋白质的结构以前,首先必须保证被测蛋白质的纯度,使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数,按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。
蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链,必须采用的化学处理方法常有:
①过甲酸氧化
用氧化剂过甲酸断裂-S-S-.这个反应一般在0℃下进行2小时左右,两个S就全部能转变成磺酸基,这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。
如果蛋白质分子中同时存在半胱胺酸,那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化,从而增加分析的复杂性。
②巯基乙醇还原
利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8?条件下室温保温几小时后,可以使-S-S-定量还原为桽H.与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性,多肽链松散成为无规则的'构型,此时还原剂就可作用于-S-S-.此反应是可逆的,因此要使反应完全,疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。
③Cleland试剂的还原作用
Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试剂,只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原,反应基本与疏基乙醇相似,且在许多球蛋白反应中,可以不用变性剂。
Cleland试剂首先与蛋白质-S-S-形成中间物,反应终了,还原剂被氧化形成一个稳定的六环化合物,蛋白质则被还原。
还原蛋白不稳定,SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定SH基的方法有:
(A)烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物。
如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸,其产物S?羧氨甲基衍生物不带电荷,磺代乙酸也可与组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸发生反应,但反应条件不同,可通过各种pH及反应时间进行控制。
(B)氨乙基化
蛋白质分子的几条肽链若以非共价健结合,则用尿素、盐酸胍等变性剂即可拆开。蛋白质的多肽链被拆开后,将它分离纯化,一般多用凝胶过滤、离子交换、电泳等方法,兹不赘述。
分离纯化后的每条肽链还要进一步分析其末端。
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